Метод серийных разведений

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков и серийных разведений

Метод серийных разведений

В медицине различают этиотропный и эмпирический подход к лечению препаратами. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам играет в этом разделении решающую роль.

Эмпирическое лечение подразумевает выяснение естественной бактериальной чувствительности и эпидемиологических сведений об устойчивости микроорганизмов.

Учитываются также данные клинических исследований, которые контролируются специалистами.

Преимуществом эмпирического подхода в назначении больному антибиотиков является то, что исключаются затраты времени, финансовых расходов на дополнительные, диагностически неинформативные исследования.

При полном отсутствии эффекта от такого лечения антибиотиками, назначают этиотропное. Назначение больному антибактериальных препаратов этиотропно подразумевает выделение возбудителя заболевания из биологического материала больного, определение чувствительности инфекционного агента к антибиотикам различных групп.

Методики установления восприимчивости

Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам разделяют на две группы. К диффузионным относятся методы:

  • с применением дисков, включающих антибиотики;
  • с применением Е-тестов.

Методики разведения для определения чувствительности выполняются:

  • с применением жидкой среды питания (бульон) – метод серийных разведений;
  • на агаре.

Согласно полученным данным, все бактерии разделяют на 3 типа:

  • чувствительные;
  • умеренно устойчивые;
  • резистентные, согласно методике пограничных концентраций.

Пограничные концентрации зафиксированы в стандартизированных данных NCCLS (США). Данные нормы применяются в клинических либо микробиологических научных исследованиях чувствительности. Наиболее часто применяют методы дисков и серийных разведений.

Чувствительность бактерий к антибиотикам предполагает анализ результатов на основании двух принципов: клинический и морфологический. Клинически определяется эффективность ведения лечения, а морфологически оценивается распределение действующих антибиотиков.

Для клинической расшифровки результата исследования оцениваются в случае использования стандартизированных доз антибактериальных препаратов для заболеваний. Лечение дает хороший положительный эффект.

Устойчивые же к антибиотикам бактерии отличаются тем, что в процессе лечения не теряют своей жизнедеятельности и способности к размножению. Такие микробы именуются как резистентные.

Существует также группа с промежуточной резистентностью бактериальной клетки. Вызываемые такими бактериями заболевания могут успешно лечиться только при использовании максимальных дозировок антибактериального препарата.

Показатель чувствительности по МБК

Иногда проведенных результатов оказывается недостаточно. В таких случаях стоит определить минимальную бактерицидную концентрацию (МБК). Данный показатель отражает минимальное количество антибактериального препарата для ликвидации микробов практически на 100% на протяжении некоторого времени.

Методика с применением дисков

Исследование чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам методом дисков заключается в засевании исследуемой культуры бактерий на среду АГВ либо питательный агар.

Затем на засеянный участок при помощи пинцета располагают специальные диски из бумаги, содержащие разные дозы лекарственных средств.

При температурном режиме 37°С выжидают сутки, одновременно оценивая зоны задержки роста культуры.

Для наиболее точных результатов рекомендуется применять стандартные питательные среды и диски. Методика дисков не отличается 100% достоверностью. Большей информативностью обладает метод серийных разведений.

Серийные разведения и их значение

Метод серийных разведений позволяет определить минимально возможную концентрацию антибактериального препарата, которая угнетает рост и размножение микробов. Начинают с приготовления основного раствора с содержанием специального растворителя и медикаментозного средства.

Затем к каждому разведению прибавляют по 0,1 мл культуры бактерий (до 107 микробов в 1 мл), одна из них (последняя) – контрольная. Затем также выжидают сутки при температуре 37°С. Все пробирки мутнеют (кроме контрольной).

В результате сравнения степени помутнения с эталоном определяют, какая бактерия подлежит устранению.

Оценивают результаты метода серийных разведений соответственно таблицам пограничных значений. При применении метода серийных разведений определяют группы чувствительных, умеренно устойчивых и устойчивых бактериальных микроорганизмов.

Источник: https://probakterii.ru/prokaryotes/in-medicine/chhuvstvitelnost-bakterij-k-antibiotikam.html

Метод серийных разведений в агаре

Метод серийных разведений
/ Отдел / Методические рекомендации и обзоры / Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам / Метод серийных разведений в агаре

Метод серийных разведений в агаре позволяет одновременно определить МПК партии штаммов (от 15 до 30 клинических штаммов + контрольные штаммы, в зависимости от используемой модели инокулятора).

Процедура

Принцип метода заключается в посеве тестируемых микроорганизмов на чашки Петри с агаром, содержащим последовательные двойные разведения антибиотиков.

Одновременно проводится тестирование партии клинических штаммов и соответствующих контрольных штаммов, а также контроль роста микроорганизмов на чашках без АБП и контроль чистоты культуры путем высева образцов инокулюма на неселективные питательные среды.

Приготовление серийных разведений АБП

Из основного раствора исследуемого АБП готовят рабочий раствор в концентрации в 10 раз превосходящей максимальную из используемых в конкретном исследовании. Затем говят серию двукратных разведений рабочего раствора.

Таким образом, концентрация в АБП в каждом последующем разведении должна быть в 2 раза меньшей чем в предыдущем.

Для приготовления серии разведений используются любые стерильные химически инертные лабораторные ёмкости с завинчивающимися крышками объёмом не менее 10 мл (для удобства размешивания).

Питательная среда

Сухая агаризованная питательная среда растворяется и автоклавируется в соответствии с инструкцией изготовителя.

После автоклавирования колбы с питательной средой помещаются на водяную баню при 48 – 50 °С, где выдерживаются до достижения указанной температуры, после чего в них асептически вносят рабочие растворы антибиотиков (1 часть рабочего раствора АБП на 9 частей расплавленного агара) и, при необходимости, термолабильные питательные добавки. Затем среду тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри, толщина слоя питательной среды должна быть 3 – 4 мм.

Вторым способом приготовления чашек Петри с агаром, содержащим разведения АБП, является смешивание питательной среды и раствора АБП непосредственно в чашке Петри.

Для приготовления стандартных пластиковых чашек диаметром 90 мм необходимо к 2 мл раствора АБП добавить 18 мл разогретого до 50 °С жидкого агара. Чашки предварительно маркируются с указанием препарата и его концентрации.

Очень важно тщательно перемешивать агар до того, как он начнёт застывать для равномерного распределения АБП по всей толще питательной среды. Перемешивание производится на горизонтальной поверхности последовательно плавными разнонаправленными круговыми движениями чашки.

После приготовления чашек агар должен затвердеть в горизонтальном положении. Нельзя резко передвигать, переносить чашки до полного застывания агара.

Параллельно с чашками Петри, содержащими растворы антибиотиков, для контроля роста готовят чашки Петри без антибиотиков. Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания и подсушивания на 10 – 12 ч.

Приготовленные указанным образом чашки Петри предпочтительнее использовать немедленно, однако допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах при + 4 – + 8 °С в течение 5 сут.

При этом необходимо иметь в виду, что некоторые бета-лактамные антибиотики (прежде всего, ампициллин, цефаклор, имипенем), особенно при низких концентрациях не выдерживают даже указанный срок хранения.

В этой связи стабильность антибиотиков в приготовленных в лаборатории чашках Петри целесообразно устанавливать экспериментально с использованием референтных штаммов.

Приготовление инокулюма и инокуляция

Конечная посевная доза исследуемого микроорганизма на поверхности питательной среды должна составлять 104 КОЕ.

Поскольку коммерческие инокуляторы или стандартная бактериологическая петля диаметром 3,0 мм переносят 1 – 2 мкл жидкости, концентрация микроорганизмов в исходной суспензии должна быть 107 КОЕ/мл.

Такую концентрацию можно получить при разведении стандартной микробной суспензии, соответствующей стандарту 0,5 по МакФарланду, в 10 раз. Полученную суспензию необходимо инокулировать на поверхность агара в течение 15 мин. после приготовления, при этом образуется пятно диаметром 5 – 8 мм.

Для контроля качества приготовления суспензий периодически рекомендуется проводить подсчет реальных колониеобразующих единиц путем высева образца приготовленного инокулюма на неселективные питательные среды.

Инкубация

После инокуляции чашки оставляют при комнатной температуре для подсыхания, далее переворачивают и инкубируют при температуре 35 °С в течение 18 – 24 ч (в зависимости от вида тестируемого микроорганизма).

Учет результатов

Учет результатов проводят, поместив чашку на темную не отражающую свет поверхность. За МПК принимают концентрацию, вызвавшую полную ингибицию видимого роста.

Для дифференцировки нежного роста от налета, оставшегося после инокулята, в ряде случаев целесообразно использовать увеличение. Появление единственной колонии на чашке с концентрацией на 1 разведение выше, чем явная МПК, можно не учитывать.

Результат оценки антибиотикочувствительности имеет смысл учитывать только при подтверждении чистоты культуры (см. контроль качества).

Контроль качества

При постановке методов серийных разведений в агаре необходимо проводить контроль роста культуры на чашке Петри с питательной средой, не содержащей АБП.

Важнейшим требованием контроля качества является высев, использованной для инокуляции суспензии на плотную неселективную среду для подтверждения чистоты культуры! Каждая партия тестируемых штаммов сопровождается внутренним контролем качества исследования с использованием соответствующих контрольных (референтных) штаммов.

Общие замечания по методам серийных разведений

Несмотря на то, что методы серийных разведений являются наиболее точными и информативными, их постановка в практических лабораториях сопряжена со значительными методическим трудностями.

Прежде всего речь идет о необходимости использования субстанций антибиотиков с известным уровнем активности, строгого соблюдения режимов хранения, тщательного выполнения контроля качества питательных сред, трудоемкости приготовления рабочих растворов антибиотиков.

Использование коммерческих тест-систем на основе метода микроразведений позволяет избегать трудоемких процедур по стандартизации подготовительных этапов, но при этом обеспечивает получение достоверных количественных результатов по уровню антибиотикорезистентности.

Весьма экономичным и простым в исполнении является также вариант метода серийных микроразведений, основанный на использовании двух пороговых концентраций, позволяющий получить качественные результаты (т.е. распределить штаммы по чувствительности на три категории).

Назад

Источник: http://www.dntpasteur.ru/metodic2_4_2_3.php

Метод серийных разведений в бульоне

Метод серийных разведений

Различают два основных варианта метода серийных разведений в бульоне: макрометод (пробирочный) и микрометод (при величине конечного объема 0,2 мл и меньше).

Метод серийных разведений в бульоне легко поддается модификациям для разработки коммерческих тест-систем.

Тестирование проводится в объеме 1 мл каждого разведения АБП с конечной концентрацией исследуемого микроорганизма примерно 5 x 105 КОЕ/мл.

Диффузионные методы менее точны, чем методы разведений, но более просты в исполнении и позволяют определять чувствительность к нескольким ЛС одновременно. Исходный метод. Метод дисков. В настоящее время вместо классического (исходного) метода повсеместно применяют модификацию, предложенную Кирби и Бауэром и признанную стандартным тестом.

Область применения макрометода из-за низкой производительности ограничивается случаями необходимости оценки чувствительности единичных штаммов. Приготовление растворов антибиотиков. Для приготовления основных растворов антибиотиков используют субстанции препаратов с известной активностью; лекарственные формы непригодны.

В связи с тем что антибактериальные препараты существенно различаются по растворимости, в ряде случаев используют разные растворители, а для доведения их до заданной концентрации — разбавители. В тех случаях, когда растворители и разбавители являются разными веществами, для солюбилизации антибиотика необходимо использовать минимально возможное количество растворителя.

Сухую агаризованную питательную среду растворяют и автоклавируют в соответствии с инструкцией изготовителя. В этой связи стабильность антибиотиков в приготовленных в лаборатории чашках Петри целесообразно устанавливать экспериментально с использованием референтных штаммов.

Жидкую питательную среду, прошедшую предварительный контроль качества, готовят в соответствии с инструкцией изготовителя. При постановке методов серийных разведений необходим контроль роста культуры в среде без антибиотика и качества с использованием референтных штаммов.

Затем ее разводят в жидкой питательной среде до концентрации 106 КОЕ/мл и вносят по 1 мл в пробирки с растворами антибиотиков.

Таким образом, конечная концентрация микроорганизмов в инкубационной среде будет равна 5 ∙ 105 КОЕ/мл. При использовании коммерческих тест-систем следует пользоваться инструкциями изготовителей.

Постановка метода в системах, изготовленных в лабораторных условиях, во многом сходна с методом серийных макроразведений.

Значительным преимуществом метода микроразведений является возможность одновременно применять достаточное количество планшетов, хранить их и использовать по мере необходимости.

После внесения рабочих растворов антибиотиков в лунки запаянные в полиэтилен планшеты могут храниться при температуре ниже —60 °С до момента использования. Суспензию исследуемого микроорганизма готовят из агаровой или бульонной культуры и доводят до заданной концентрации. Инокуляцию проводят в течение 15 мин после приготовления суспензии.

Общие замечания по методам серийных разведений. Наибольшее значение проблема устойчивости микроорганизмов имеет в отношении стафилококков, шигелл, эшерихий, протея, среди которых антибиотикоустойчивые штаммы выделяются с наибольшей частотой.

1.6 Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам

Если он угнетается при применении только максимальных доз препаратов, то такие микроорганизмы умеренно чувствительны к антибиотику. Концентрация антибиотиков в тканях и жидкостях организма, как и их антимикробная активность, относятся к основным параметрам, определяющим эффективность антибиотикотерапии.

В зависимости от объема используемой жидкой питательной среды выделяют методы серийных макро — и микроразведений. В настоящее время существуют две основные модификации диффузионного метода: диско-диффузионный и Е-тест.

Приготовление серийных разведений АБП (рис. 1)

Подавление роста микроорганизма вокруг полоски Е-теста происходит только в той зоне, где концентрация АБП, диффундирующего из носителя, выше МПК, при этом образуется каплевидная зона ингибиции.

Значения концентрации АБП в каждом участке носителя типографским способом нанесены на наружной (обращенной к исследователю) поверхности Е-теста.

Величину МПК учитывают в том месте, где граница зоны подавления роста вплотную подходит к носителю.

Вид питательной среды для оценки чувствительности определяют выбранным методом проведения исследования (агар или бульон), а также видом тестируемого микроорганизма.

Общим и принципиально важным для всех методов тестирования является стандартизация суспензии исследуемого микроорганизма, ее концентрация должна составлять 1,5´108 КОЕ/мл.

Практически наиболее приемлемым методом оценки концентрации бактериальной суспензии является измерение ее оптической плотности.

Приготовление инокулюма и инокуляция

Для приготовления инокулюма используют чистую суточную культуру микроорганизмов, выросших на плотных питательных средах. Инокулюм следует использовать в течение 15 минут после приготовления.

При определении чувствительности быстро растущих бактерий с обычными питательными потребностями для приготовления инокулюма также можно использовать 5-6 часовую бульонную культуру микроорганизма. Стандарт МакФарланда может быть либо приобретен,либо приготовлен в лаборатории.

Методы определения

Полученную суспензию необходимо разлить по 4–6 мл в пробирки с герметично закрывающимися крышками. Пробирки должны быть такого же диаметра, как и используемые для приготовления бактериальной суспензии. Хранить пробирки с суспензией необходимо в темноте при комнатной температуре. Перед использованием пробирки необходимо тщательно встряхивать и оценивать однородность суспензии.

Для взвешивания субстанций необходимо использовать электронные лабораторные весы с точностью до 4 знака, для измерения объёмов – калиброванные дозаторы и пипетки. Диапазон двукратных серийных разведений АБП зависит от вида тестируемого микроорганизма, предполагаемой активности АБП и целей исследования.

Источник: http://zdravbaza.ru/metod-seriynyih-razvedeniy-v-bulone/

Мое Здоровье
Добавить комментарий